Gluconeogenese betekent het opnieuw vormen van glucose. Bij gluconeogenese wordt glucose uit niet-koolhydraatbronnen zoals aminozuren en glycerol, maar vooral uit pyrodruivenzuur, gemaakt. Verder kunnen naast pyrodruivenzuur ook glycerine, di- of tricarbonzuren als uitgangsstof dienen. De glycerine (ook glycerol genaamd) is van de afbraakvan vetten afkomstig en de di- en tricarbonzuren van afbraak van aminozuren uit voedsel of bij onvoldoende voedsel (honger) uit het spierweefsel.
Gluconeogenese vindt bij de mens vooral in de lever plaats en in mindere mate in de nieren. Ze is vooral belangrijk als er door zware inspanning veel melkzuur gevormd wordt, en bij honger om de bloedsuikerspiegel op peil te houden. Dit melkzuur kan gemakkelijk omgezet worden in pyrodruivenzuur dat in de gluconeogenese gebruikt wordt. De gluconeogenese staat onder invloed van het hormoon cortisol uit de bijnierschors en voorziet in glucose als er te weinig glucose in de cellen aanwezig is en als de hoeveelheid melkzuur in het bloed toeneemt. De keuze in het lichaam voor gluconeogenese in plaats van glycolyse is zeer belangrijk, omdat gluconeogenese energie kost terwijl glycolyse energie oplevert. Het hormoon glucagon stopt, bij een te laag glucosegehalte in het bloed, de glycolyse en start de gluconeogenese.